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綿羊痘(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LDSV)核酸檢測試劑
(熒光PCR法,外源內(nèi)標(biāo))
包裝規(guī)格:48 T/盒
產(chǎn)品說明:
采用Taqman探針技術(shù),以羊痘病毒屬(GaPV)中綿羊痘病毒(SPPV)、山羊痘病毒(GTPV)和牛結(jié)節(jié)性皮膚病病毒(LDSV)的特異性保守基因?yàn)榘形稽c(diǎn)設(shè)計(jì)特異性引物和探針,用于樣品中SPPV、GTPV和LDSV核酸的輔助檢測。本產(chǎn)品引入了dUTP / UDG 系統(tǒng),可降解含U的ssDNA和dsDNA,消除由PCR產(chǎn)物導(dǎo)致的交叉污染。 同時(shí)設(shè)置陽性內(nèi)對(duì)照 (即內(nèi)標(biāo),使用VIC報(bào)告基團(tuán)),通過檢測內(nèi)標(biāo)是否正常來監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物,避免出現(xiàn)假陰性結(jié)果。
產(chǎn)品組成:
組分名稱 | 主要成分 | DV231Y-21-V1 | |
1 | GaPV PreMix-2 | qPCR反應(yīng)緩沖液、dNTPs、UDG酶、Taq酶、引物、探針等 | 960 μL/管 |
2 | GaPV陰性對(duì)照-2 | 無酶水 | 400 μL/管 |
3 | GaPV內(nèi)標(biāo)對(duì)照-2 | 含內(nèi)標(biāo)擴(kuò)增片段的核酸 | 480 μL/管 |
4 | GaPV陽性對(duì)照-2 | 含目標(biāo)擴(kuò)增片段的核酸 | 50 μL/管 |
注:不同批號(hào)產(chǎn)品的成分之間不可以混用或互換!!!
儲(chǔ)存條件和保質(zhì)期:
在-20±5℃避光儲(chǔ)存,有效期12月。干冰運(yùn)輸。重復(fù)凍融小于5次。生產(chǎn)日期,失效日期請見外包裝盒。
適用儀器:
ABI7500、宏石96P、Bio-Rad CFX96實(shí)時(shí)熒光PCR儀等。
樣品要求:
1、適用樣品類型
活體或剖檢牛羊的皮膚丘疹、肺部病變組織、淋巴結(jié)、血液等樣品。
要求送檢新鮮樣品,禁止反復(fù)凍融!
2、樣品處理(核酸提取區(qū))
參照《NY/T 541-2016 獸醫(yī)診斷樣品采集、保存與運(yùn)輸技術(shù)規(guī)范》等標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行樣品前處理, 使用商業(yè)化的提取試劑盒提取樣品中的核酸。提取時(shí),每200 μL陰性對(duì)照和處理后的樣品溶液中添加10 μL內(nèi)標(biāo)對(duì)照,提取后的核酸應(yīng)立即檢測,否則凍存于-20±5℃,保存時(shí)間不超過6個(gè)月,禁止反復(fù)凍融!
*內(nèi)標(biāo)對(duì)照的其它使用方法:將內(nèi)標(biāo)對(duì)照混入 qPCR工作液中,但僅僅質(zhì)控?cái)U(kuò)增過程和監(jiān)測qPCR體系中是否含有 PCR抑制物,不能質(zhì)控提取核酸過程。
檢測方法
為了防止污染,實(shí)驗(yàn)需分區(qū)操作!!!
注:核酸提取參照樣品要求,在核酸提取區(qū)進(jìn)行或在樣品處理區(qū)進(jìn)行。
1、試劑準(zhǔn)備 (在試劑準(zhǔn)備區(qū)進(jìn)行)
(1) 推薦方式(內(nèi)標(biāo)對(duì)照質(zhì)控核酸提取和核酸擴(kuò)增過程)
取出試劑盒中的各組分以及自備試劑,室溫放置,待溫度平衡至室溫,混勻后備用;
根據(jù)檢測樣品數(shù)量,建議每次檢測均設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。將所需數(shù)量(N)的GaPV PreMix-2分配到每個(gè)微離心管(如八連管)中,20 μL/管。待檢樣品數(shù)為n時(shí),所需反應(yīng)數(shù)N=樣品數(shù)(n)+陽性對(duì)照(1)+陰性對(duì)照(1);
當(dāng)準(zhǔn)備使用時(shí),再轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。
(2) 其它方式(內(nèi)標(biāo)對(duì)照僅質(zhì)控核酸擴(kuò)增過程)
根據(jù)所檢測的樣品數(shù)量按照下表配制反應(yīng)液,建議每次檢測均設(shè)置陰性對(duì)照和陽性對(duì)照。待檢樣品數(shù)為n時(shí), 需配制反應(yīng)體系數(shù)N=待檢樣品數(shù)(n) +陽性對(duì)照(1)+陰性對(duì)照(1)+1。
*qPCR工作液配制表(其它方式)
組份 | 每反應(yīng)體積(μL) |
GaPV PreMix-2 | 20 μL×N |
GaPV內(nèi)標(biāo)對(duì)照-2 | 0.5 μL×N |
*注:本配制方法為在提取樣品核酸未加內(nèi)標(biāo)對(duì)照時(shí)的補(bǔ)救方法,不推薦。
將配制好的qPCR工作液充分混勻后瞬時(shí)離心,待用;當(dāng)準(zhǔn)備使用時(shí),將等量的20 μL分配到每個(gè)微離心管(如八連管)中,并轉(zhuǎn)移到樣品處理區(qū)。
2、樣品加樣 (在樣品處理區(qū)進(jìn)行)
在每個(gè)PCR管中加入5 μL經(jīng)提取的待測樣品和陰性對(duì)照、陽性對(duì)照,蓋上管蓋, 瞬時(shí)離心,使液體全部沉于管底。
3、qPCR擴(kuò)增 (在擴(kuò)增與分析區(qū)進(jìn)行)
(1) 熒光通道選擇
熒光基團(tuán)選擇FAM通道檢測GaPV;選擇VIC 通道檢測內(nèi)標(biāo);淬滅基團(tuán)設(shè)置為none。如ABI qPCR儀,還需設(shè)置Passive Reference為none。其它儀器參考儀器說明書。
(2) qPCR擴(kuò)增程序設(shè)置
設(shè)置反應(yīng)體系為25 μL。
步驟 | 溫度 | 反應(yīng)時(shí)間 | 循環(huán) | |
UDG消化 | 50℃ | 5 min | 1 | |
預(yù)變性 | 95℃ | 30 sec | 1 | |
擴(kuò)增 | 變性 | 95℃ | 5 sec | 45 |
退火與延伸 | 60℃ | 35 sec,數(shù)據(jù)收集 |
4、結(jié)果分析 (以ABI7500 qPCR儀為例)
反應(yīng)結(jié)束后,qPCR儀將自動(dòng)生成結(jié)果。若儀器自動(dòng)生成的擴(kuò)增曲線或閾值線有異常,用戶可根據(jù)實(shí)際情況自行調(diào)整,基線Start值可以在 3~10,基線End值可設(shè)在 5~20,調(diào)整各擴(kuò)增曲線的基線區(qū)相對(duì)水平即可。點(diǎn)擊Analyze 進(jìn)行分析。
5、質(zhì)量控制
試劑盒中各控制項(xiàng)應(yīng)符合下列要求,否則實(shí)驗(yàn)無效。
陽性對(duì)照 | 陰性對(duì)照 | |
FAM通道(GaPV) | Ct≦32 | 無Ct值或Ct>40 |
VIC通道 (內(nèi)標(biāo)) | 無Ct值或Ct>40 | 典型的S形曲線,Ct≦35 |
參考qPCR工作液配制表(其它方式)配制時(shí),陽性對(duì)照的VIC通道應(yīng)均出現(xiàn)S型曲線,Ct值≦35。
檢驗(yàn)結(jié)果的解釋
(1)若樣品的VIC通道呈典型的S形曲線且Ct≦35時(shí),
A. 當(dāng)FAM通道Ct≦35,判定為GaPV陽性;
B. 當(dāng)FAM通道Ct值在35到40之間時(shí),需要觀察靶基因的擴(kuò)增曲線是否呈S形,如果曲線呈S形,樣品應(yīng)視為疑似GaPV陽性,需重新檢測;復(fù)測結(jié)果若Ct值≦40且具有典型S形曲線,判定為GaPV陽性;反之若為無Ct顯示、Ct>40或無典型S形曲線,則判定為GaPV陰性。
C. 當(dāng)FAM通道Ct>40,判定為GaPV陰性。
(2)如果VIC通道的Ct值高于35,而沒有顯示明顯的S形擴(kuò)增曲線,原因如下:
1) 樣品中存在PCR抑制劑,建議實(shí)驗(yàn)前稀釋模板。
2) 核酸提取操作存在缺陷,建議重復(fù)核酸提取進(jìn)行檢測。
3) 在處理過程中沒有獲得合格的樣品,或者在運(yùn)輸和儲(chǔ)存過程中樣品已經(jīng)降解,建議重新采樣。
檢驗(yàn)方法的局限性
1) 陰性結(jié)果可能是由于從樣品中提取的核酸質(zhì)量低,儲(chǔ)存條件不當(dāng),儲(chǔ)存期不合適,樣品中存在抑制劑,核酸降解和核酸提取方法的提取效率差等原因。
2) 不合理的樣品采集、運(yùn)送與保存條件,樣品中病毒含量過低,或不合理的實(shí)驗(yàn)操作和環(huán)境很可能造成假陰性或假陽性結(jié)果。其它臨床觀察和相關(guān)資料應(yīng)結(jié)合測定,必要時(shí)再次進(jìn)行檢測。
3) 由于突變或其它原因,靶序列的序列變化可能會(huì)產(chǎn)生假陰性結(jié)果。
注意事項(xiàng):
1) 本產(chǎn)品僅用于科研使用,使用前請仔細(xì)閱讀本說明書。
2) 實(shí)驗(yàn)前請熟悉和掌握需使用的各種儀器的操作方法和注意事項(xiàng),對(duì)每次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行質(zhì)量控制。
3) 實(shí)驗(yàn)室管理需嚴(yán)格遵照PCR基因擴(kuò)增實(shí)驗(yàn)室的管理規(guī)范,實(shí)驗(yàn)人員必須進(jìn)行專業(yè)培訓(xùn),實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格分區(qū)進(jìn)行, 所有消耗品僅作一次性使用,實(shí)驗(yàn)操作的每個(gè)階段使用專用儀器和設(shè)備,各區(qū)各階段用品不可交叉使用。
4) 所有檢測樣品均視為具有傳染性的物質(zhì),實(shí)驗(yàn)過程中穿工作服并經(jīng)常更換手套,以避免樣品間的交叉污染;
5) 樣品操作、廢棄物處理應(yīng)符合相關(guān)法規(guī)要求:《微生物生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室生物安全通用準(zhǔn)則》和《醫(yī)療廢物管理 條例》。
6) 所有試劑 (包括本產(chǎn)品中的組分與客戶自備試劑) 使用前均需徹底化凍、混勻。
7) 血液類樣品溶血嚴(yán)重時(shí),會(huì)使擴(kuò)增曲線高度顯著下降。因此,當(dāng)使用該試劑盒同時(shí)檢測血液樣品原液和生理鹽水稀釋 樣品時(shí),建議對(duì)2類模板分別設(shè)置不同的閾值線,以保證結(jié)果的準(zhǔn)確性。
8) 當(dāng)出現(xiàn)多個(gè)樣品的Ct值>40時(shí),可能是qPCR儀自動(dòng)生成的閾值線較高的原因,建議將閾值線高度設(shè)置在擴(kuò)增曲線 最大熒光值的1/15左右后,重新分析。
本產(chǎn)品僅供科研使用,檢測結(jié)果不能用作臨床診斷判斷唯一依據(jù)
從2011年開始我們致力于在生命科學(xué)領(lǐng)域、生物醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)技術(shù)及論文潤色服務(wù),協(xié)助客戶各類實(shí)驗(yàn)服務(wù)及論文潤色十余年,是您值得信賴的科研合作伙伴!
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